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[THESE] Amélioration des image en microscopie de localisation super-résolue (PALM) dans des milieux épais et hétérogènes grâce à la co-conception de masques de phases optimaux et d’algorithmes de traitement d’images

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  • Thèse et post-doc
  • Laboratoire Charles Fabry (Palaiseau)
  • Laboratoire Charles Fabry, Imagerie et Information

Contexte

Aujourd'hui plus que jamais, le microscope optique est un outil incontournable du biologiste. Visualiser en direct des processus cellulaires aussi précis que le recrutement dynamique de calcium qui intervient dans la plasticité des neurones, ou le devenir de certaines protéines lors de la division cellulaire, sont des prouesses rendues possibles grâce à une nouvelle méthode d’imagerie appelée microscopie par localisation photo-activée (ou imagerie PALM). Cette méthode permet, grâce à des techniques élaborées de traitement d’images, d’estimer la position d’une particule fluorescente avec une précision bien supérieure à la limite de diffraction et ainsi de reconstruire des images dites « super-résolues » ayant une résolution nanométrique [1].

Avec les microscopes PALM, les biologistes essaient aujourd'hui de faire des images dans des milieux biologiques de plus en plus épais et inhomogènes, ce qui pose des problèmes importants. Tout d'abord, l'image des particules peut ne plus être focalisée, ce qui entraîne une forte dégradation de la résolution latérale. Il est donc nécessaire d'augmenter la "profondeur de champ" du microscope, c'est-à-dire sa capacité à produire une image nette sur une grande distance axiale. D’autre part, dans certaines applications, il est nécessaire d'estimer la position tridimensionnelle de la particule dans le volume de l'échantillon.

Ces problèmes peuvent être résolus en plaçant des masques de phase optimisés dans la pupille de l'objectif du microscope et en développant des algorithmes de traitement adaptés. Notre équipe a développé des masques optimaux destiné à étendre la profondeur de champ en imagerie classique [2,3] et a récemment généralisé cette approche à la microscopie PALM [4]. Nous avons montré que cette nouvelle méthode augmente considérablement la profondeur d'exploration des méthodes d'imagerie par la localisation (voir Figure 1), ce qui est un enjeu fondamental dans l'étude des milieux biologiques. D'autre part, d'autres types de masques de phase où la variation du PSF le long de l'axe optique encode la position de la particule ont été développés pour estimer la position des particules en trois dimensions [5,6].

Figure 1 : (a) Masque de phase binaire annulaire optimal à cinq anneaux. (b) Profil transversal de la PSF en fonction de la défocalisation. (c) Précision de localisation sans masque (ligne pointillée) et avec le masque de phase optimal (ligne continue) en fonction de la défocalisation [4]

Le projet

L'étape finale de la chaîne d'imagerie PALM est un algorithme de traitement d'image qui extrait les positions des particules. Les masques de phase doivent donc être optimisés en prenant en compte cet algorithme. Ce processus d'optimisation conjointe d'un système optique et d'un algorithme de traitement est appelé "co-conception". Il est clair que les masques co-conçus doivent être adaptés aux exigences spécifiques de chaque application. En effet, ils sont le résultat d’un compromis entre la précision de localisation requise (en 2D ou 3D), l’épaisseur et la non-homogénéité de l'échantillon, et le nombre de photons disponible, qui est lié au temps disponible pour effectuer la mesure et à la résistance de l’échantillon à la phototoxicité. On a donc besoin de méthodes de co-conception suffisamment souples pour s’adapter aux paramètres et aux contraintes liés à chaque application d'imagerie PALM. L'objectif de ce projet est de concevoir un tel environnement de co-conception et de le mettre en application dans le domaine de l’imagerie des milieux biologiques.

Les masques co-conçus seront optimisés et évalués par des simulations. Ils seront validés expérimentalement par des mesures réelles effectuées par l'équipe du laboratoire d'optique et de biologie du LP2N, partenaire de ce projet. Cette équipe utilise des microscopes PALM et est reconnue dans le monde entier pour son expertise dans domaine de la microscopie à très haute résolution pour l'étude de la matière biologique et nanométrique [7]. Grâce à cette approche interdisciplinaire, notre objectif est d’apporter des améliorations décisives à l'imagerie PALM appliquée aux sciences de la vie et à la biologie moléculaire.

Le plan de travail

Ce projet est constitué de trois blocs étroitement interconnectés.

  1. Réalisation d’un environnement de simulation d'images qui intègre les éléments suivants :
    1. Un modèle réaliste de la PSF en trois dimensions en présence d'un masque de phase dans la pupille de l’objectif, basé sur le modèle de Gibson et Lanni.
    2. Un modèle réaliste du fond sur lequel les particules apparaissent. Les propriétés du fond dépendent fortement de l'application et de l'échantillon observé. Comme référence, nous utiliserons des fonds extraits d'images réelles acquises par le LPN.
  2. Définition d’une méthodologie d'optimisation des masques de phase adaptée aux contraintes de chaque application, telles que :
    1. Le compromis entre la précision 2D et la profondeur de champ ou la précision 3D.
    2. Le budget de photons : temps d'acquisition disponible, performance des fluorophores, résistance de l'échantillon à la phototoxicité.
    3. Le compromis entre performance de pré-détection des particules et précision de localisation sub-pixel.
    L'optimisation des masques sera faite en tenant compte de la probabilité de détection des fluorophores et de la précision de localisation à travers la borne de Cramer-Rao [4,7]. Un paramètre important sera la paramétrisation adéquate de la fonction de phase des masques (phase binaire, bases polynomiales telles que Zernike ...)
  3. Conception d’une chaîne complète de traitement des images PALM adaptée à l’extension de profondeur de champ et à la localisation 3D. En particulier :
    1. Conception de nouvelles méthodes de pré-détection de particules en présence d'aberrations non contrôlées et de fonds non uniformes. Les concepts et méthodes de la théorie de la détection et du machine learning seront utilisés pour traiter les arrière-plans complexes.
    2. Conception d'algorithmes pour la localisation précise des particules en 2D lorsque la PSF du microscope n'est que partiellement connue et varie avec la profondeur.
    3. Conception d'algorithmes pour l'estimation de la position 3D des particules avec des masques de phase optimisés dans ce but.
    Les travaux sur ces 3 blocs seront menés en parallèle, en augmentant progressivement la complexité et le réalisme des milieux simulés, des masques optimaux et des algorithmes de traitement. Les résultats de ces études conduiront à revisiter les critères d'optimisation des masques d’extension de profondeur de champ et de localisation 3D, et ainsi à concevoir de nouvelles formes de masques plus adaptées aux conditions réelles d'imagerie. Les résultats seront validés expérimentalement par des mesures réelles effectuées sur des microscopes LP2N.

Le·la candidat·e

Ce projet fait appel à des compétences interdisciplinaires incluant la modélisation optique et le traitement des images. Le ou la candidat·e retenu·e possédera idéalement des compétences dans ces deux domaines. Toutefois, ce projet convient aussi parfaitement à un·e physicien·ne qualifié·e souhaitant développer ses connaissances en matière de traitement d'images, ou à un·e spécialiste du traitement d'images cherchant à améliorer ses compétences en modélisation physique.

Références

[1] E. Betzig et al. “Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution” Science 313, 1642–1645 (2006).

[2] F. Diaz et al., “Real-time increase in depth of field of an uncooled thermal camera using several phase-mask technologies”, Opt. Lett. 36 (3), 418-420 (2011).

[3] R. Falcón, F. Goudail, C. Kulcsár, H. Sauer, “Performance limits of binary annular phase masks codesigned for depth-of-field extension,” Opt. Eng. 56(6), 065104 (2017).

[4] O. Lévêque et al, “Co-designed annular binary phase masks for depth-of-field extension in single-molecule localization microscopy”, Opt. Express 28, 32426-32446 (2020).

[5] S. R. Pavani et al. ”Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function”, PNAS, 106, 2995--2999, (2009).

[6] Y. Shechtman, S.J. Sahl, A.S.Backer and W.E. Moerner, “Optimal point spread function design for 3D imaging“, Physical Review Letters 113, 133902 (2014).

[7] P. Bon, J. Linarès-Loyez, M. Feyeux, K. Alessandri, B. Lounis, P.Nassoy, L. Cognet, “Self-interference 3D super-resolution microscopy for deep tissue investigations”, Nature Methods 15, 449–454 (2018)

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