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[STAGE] Modèles et algorithmes pour l’augmentation de profondeur de champ en microscopie de localisation super-résolue (PALM)

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  • Laboratoire Charles Fabry (Palaiseau)
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Contexte

La microscopie de localisation photo-activée (PALM) permet, grâce à des microscopes performants et des techniques de traitement d'image avancées, d'estimer la position d'une particule fluorescente avec une précision bien supérieure à la limite de diffraction et ainsi de reconstruire des images "super-résolues" ayant une résolution nanométrique [1,2] (Fig. 1). Les biologistes souhaitent aujourd'hui imager des milieux biologiques épais, et la profondeur de champ (PdC) naturelle des microscopes PALM standards n'est pas suffisante. Il est donc nécessaire d'augmenter cette profondeur de champ [3,4] et, dans certaines applications, d'estimer la position tridimensionnelle de la particule dans le volume de l'échantillon [5-7].

Image de bactérie par microscopie de fluorescence

Figure 1: (gauche) Image de bactérie par microscopie de fluorescence. Résolution ~200 nm (limite de diffraction). (droite) Image du même échantillon avec un microscope PALM. Résolution: 10 nm. Crédit: Antony Lee, Univ. of California, Berkeley.

La PdC peut être augmentée en plaçant des masques de phase optimisés dans le diaphragme d'ouverture du microscope afin de contrôler la variation de la fonction d'étalement du point (FEP, ou PSF en anglais pour Point Spread Function) avec la profondeur, et en appliquant des algorithmes de traitement adaptés [3,4]. On voit sur la figure 2 qu'avec un tel masque, la PSF du microscope reste contrastée et la précision de localisation varie très peu avec la défocalisation. Cette nouvelle technique augmente considérablement la profondeur d'exploration des méthodes d'imagerie de localisation de molécules uniques, qui est une problématique fondamentale dans l'étude des milieux biologiques.

Microscope avec masque de phase

Figure 2: (gauche) Microscope avec masque de phase. (milieu) PSF à différentes profondeurs, sans masque et avec masque optimal. (droite) Précision de localisation sans masque (bleu) et avec masque de phase optimal (rouge) en fonction de la défocalisation.

Sujet du stage

Il est clair que les masques de phase optimaux dépendent des exigences spécifiques de chaque application. En effet, leur optimisation est un compromis entre la précision de localisation, la profondeur d'exploration et le bilan photonique (qui est lié à la fréquence d'imagerie et aux problèmes de phototoxicité). Aujourd’hui, les biologistes doivent être capables de concevoir le bon masque pour chaque application.

Pour répondre à cette problématique, nous travaillons en collaboration avec l’équipe du laboratoire LP2N en Optique et Biologie, qui met en œuvre des microscopes PALM et est reconnue mondialement pour son expertise dans le développement de la microscopie à très haute résolution pour l’imagerie biologique. Nous avons récemment mis en œuvre sur ces microscopes des masques optimaux de type « binaire annulaire » et avons la possibilité d’acquérir des images à profondeur de champ augmentée pour différentes applications.

L’objectif du stage est de concevoir des méthodes de modélisation des images, de traitement des données et d’optimisation des masques adaptés aux données expérimentales acquises. Les efforts porteront en particulier sur les points suivants :

  • Proposer des améliorations du dispositif expérimental à partir de l’analyse des précisions de localisation obtenues sur les images réelles.
  • Améliorer les modèles de formation d’image utilisés pour l’optimisation des masques en tenant compte des observations expérimentales, en particulier des aberrations présentes dans les images réelles. L’objectif est d’obtenir une modélisation la plus conforme possible aux résultats expérimentaux.
  • Les algorithmes de localisation actuels reposent sur l’hypothèse que la PSF du microscope à chaque profondeur est parfaitement connue. Cela n’est jamais le cas dans la pratique, en raison des défauts expérimentaux et des aberrations présentes dans le système. On étudiera donc des méthodes de localisation robustes à une connaissance partielle de la PSF.
  • En utilisant le retour d’expérience, on revisitera les méthodes d’optimisation de masques pour mieux s’adapter aux réalités expérimentales et aux objectifs finaux de de l’imagerie (quelle information souhaite-t-on extraire de l’image microscopique) ?

Profil recherché

Ce projet fait appel à des compétences interdisciplinaires et requiert une motivation pour la modélisation optique et le traitement des images. Le ou la candidate retenue possèdera idéalement des compétences dans ces deux domaines. Cependant, ce projet convient aussi parfaitement à une personne compétente en physique et désireuse de développer ses connaissances en traitement d'images, ou bien compétente en traitement d’image et souhaitant améliorer ses connaissances en modélisation optique.

Ce stage peut donner lieu à une poursuite en thèse.

Références

[1] E. Betzig et al. “Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution” Science 313, 1642–1645 (2006).

[2] A. Lee, K. Tsekouras, C. Calderon,C. Bustamante, S. Pressé, "Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis", Chem. Rev. 117, 7276−7330 (2017)

[3] O. Lévêque, C. Kulcsár, A. Lee, H. Sauer, A. Aleksanyan, P. Bon, L. Cognet, and F. Goudail, “Co-designed annular binary phase masks for depth-of-field extension in single-molecule localization microscopy”, Opt. Express 28, 32426-32446 (2020).

[4] O. Lévêque, R. Duverger, H. Sauer, C. Kulcsar, F. Goudail , “Influence of high numerical aperture on depth-of-field enhancing phase mask optimization in localization microscopy,” J. Opt. Soc. Am. A 38, 1380-1390 (2021)

[5] S. R. Pavani et al. ”Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function”, PNAS, 106, 2995--2999, (2009).

[6] Y. Shechtman, S.J. Sahl, A.S.Backer and W.E. Moerner, “Optimal point spread function design for 3D imaging“, Physical Review Letters 113, 133902 (2014).

[7] Y. Zhou, G. Carles, "Precise 3D particle localization over large axial ranges using secondary astigmatism", Opt. Lett. 45, 2266 (2020)

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