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[STAGE] Masques de phases optimisés pour l’augmentation de profondeur de champ en microscopie de molécules uniques

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  • Laboratoire Charles Fabry (Palaiseau)
  • Laboratoire Charles Fabry, Imagerie et Information

Contexte

La microscopie de la molécule unique est une modalité très importante en imagerie pour la biologie. Elle permet d’estimer la position d’une particule fluorescente avec une précision bien supérieure à la  limite de diffraction et ainsi de reconstruire des images de « super-résolution » ayant des résolutions nanométriques [1]. Aujourd'hui, avec ce mode d'imagerie, on cherche à imager des milieux de plus en plus épais et de moins en moins transparents. Dans ce cas, l’image des particules n’est plus focalisée, ce qui entraîne une dégradation de la résolution de l’image. Il faut donc augmenter la « profondeur de champ » du microscope, c’est-à-dire rendre la tache image (PSF) la plus invariante possible le long de l’axe optique, tout en minimisant la dégradation de la résolution latérale.

Notre équipe développe depuis plusieurs années des masques de phase placés dans la pupille d'une optique afin d'étendre sa profondeur de champ en imagerie classique [2,3]. L'objectif de ce projet est de développer des masques d'augmentation de la profondeur de champ et des algorithmes de localisation adaptés à la microscopie de molécules uniques. D’un point de vue applicatif, cette nouvelle technique augmentera de manière significative la profondeur d'exploration des méthodes d'imagerie de la molécule unique, ce qui est un enjeu fondamental dans l'étude des milieux biologiques. Ce projet est réalisé en étroite collaboration avec l’équipe du laboratoire LP2N (Bordeaux) en Optique et Biologie qui est reconnue mondialement pour son expertise dans le développement de la microscopie à très haute résolution pour l’étude de la matière biologique et nanométrique [4].

Dans le cadre de ce projet, nous avons déjà démontré que dans des conditions idéales, les masques binaires rendent la précision de localisation beaucoup plus invariante avec la défocalisation (voir Figure). Nous avons également développé un algorithme permettant d’optimiser la précision de localisation des molécules [5].

Légende de la Figure: (gauche) Masque optimal à deux anneaux. (centre) Variation du profil transversal de la PSF en fonction de la défocalisation lorsque le microscope est équipé d’un masque optimal. (droite) Ecart-type de localisation d’une molécule (borne de Cramer-Rao) sans masque (pointillés) et avec masque (bleu) en fonction de la défocalisation.

Objectifs

L’objectif du stage est d’étendre les résultats déjà obtenus à des situations expérimentales plus réalistes, en tenant compte des aberrations optiques introduites par le milieu épais observé et de la forte ouverture numérique du microscope. Les principales étapes du travail seront les suivantes.

  • Etude bibliographique sur la modélisation des aberrations en microscopie et l’effet de la grande ouverture sur la forme des PSF et sur leur variation avec la focalisation. Réalisation d’un programme de simulation des PSF d’un microscope à grande ouverture observant un milieu aberrant.
  • Définition et mise en œuvre d’une méthode d’optimisation des masques binaires annulaires pour la localisation de molécules uniques en tenant compte des aberrations et de la forte ouverture du microscope.
  • Conception d’un algorithme de la localisation adapté à ce type de masques. Evaluation de la performance atteinte.
  • Comparaison du masque binaire annulaire optimal avec d’autres types de masques  optimisés pour optimiser le compromis performance / simplicité de fabrication.
  • Utilisation des résultats précédents pour spécifier un masque à réaliser et à insérer dans un microscope.  Si le temps le permet, de premières expériences seront réalisées en conditions réelles sur un microscope du LP2N pour valider expérimentalement cette méthode.

Ce projet fait appel à des compétences en modélisation, en optimisation et de traitement d’image avancé. Il permettra d’acquérir des compétences solides en traitement des images en relation avec la physique des systèmes d’imagerie et la microscopie pour la biologie.

Au cours de ce projet, le ou la stagiaire interagira de manière étroite avec les chercheurs impliqués dans ce projet au LCF et au LPN. L’objectif final  est de spécifier un masque et un algorithme pouvant être implémentés en pratique  sur les microscopes l’équipe du laboratoire LP2N en Optique et Biologie.

Dates du stage : mars-août 2020

Mots clés : traitement d’images, microscopie,  imagerie pour la biologie, co-conception, borne de Cramer-Rao

Références

[1] E. Betzig et al. “Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution” Science 313, 1642–1645 (2006).

[2] F. Diaz et al., “Real-time increase in depth of field of an uncooled thermal camera using several phase-mask technologies”, Opt. Lett. 36 (3), 418-420 (2011).

[3] R. Falcón, F. Goudail, C. Kulcsár, H. Sauer, “Performance limits of binary annular phase masks codesigned for depth-of-field extension,” Opt. Eng. 56(6), 065104 (2017).

[4] P. Bon, J. Linarès-Loyez, M. Feyeux, K. Alessandri, B. Lounis, P.Nassoy, L. Cognet, “Self-interference 3D super-resolution microscopy for deep tissue investigations”, Nature Methods 15, 449–454 (2018)

[5] O. Lévêque, C.Kulcsár, F. Goudail « Binary annular phase masks co-designed for DoF extension in single-molecule microscopy », Journée Co-conception de systèmes hybrides (GDR ISIS), 24 octobre 2019, Paris.

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