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[STAGE] Comment augmenter la profondeur de champ en microscopie super-résolue (PALM) ?

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  • Laboratoire Charles Fabry (Palaiseau)
  • Laboratoire Charles Fabry, Imagerie et Information

Contexte

Aujourd'hui plus que jamais, le microscope optique est un outil incontournable du biologiste. Visualiser en direct des processus cellulaires aussi précis que le recrutement dynamique de calcium qui intervient dans la plasticité des neurones, ou le devenir de certaines protéines lors de la division cellulaire, sont des prouesses rendues possibles grâce au développement d'une nouvelle méthode d’imagerie appelée microscopie par localisation photo-activée (ou imagerie PALM).

Cette méthode permet d’estimer la position d’une particule fluorescente avec une précision bien supérieure à la limite de diffraction et ainsi de reconstruire des images dites « super-résolues » ayant une résolution nanométrique [1]. Avec cette approche, les biologistes cherchent aujourd’hui à imager des milieux biologiques de plus en plus épais et de moins en moins transparents. Dans ce cas, l’image des particules n’est plus focalisée, ce qui entraîne une forte dégradation de la résolution. Il faut donc augmenter la « profondeur de champ » du microscope, c’est à dire améliorer la précision de localisation d’une particule fluorescente le long de l’axe optique.

Notre équipe développe depuis plusieurs années des masques de phase placés dans la pupille d'une optique afin d'étendre sa profondeur de champ en imagerie classique [2,3]. Nous avons récemment généralisé cette approche pour développer des masques d'augmentation de la profondeur de champ et des algorithmes de traitement adaptés à la microscopie PALM [4]. D’un point de vue applicatif, nous avons montré par de simulations numériques que cette nouvelle approche augmente de manière significative la profondeur d'exploration des méthodes d'imagerie de localisation de la molécule unique (voir Figure 1), ce qui est un enjeu fondamental dans l'étude des milieux biologiques.

Ces travaux sont menés en étroite collaboration avec l’équipe du laboratoire LP2N en Optique et Biologie. Cette équipe met en œuvre des microscopes PALM et est reconnue mondialement pour son expertise dans le développement de la microscopie à très haute résolution pour l’étude de la matière biologique et nanométrique [5].

Figure 1 : (a) Masque optimal à deux anneaux. (b) Variation du profil transversal de la PSF en fonction de la défocalisation lorsque le microscope est équipé d’un masque optimal. (c) Précision de localisation sans masque (pointillés) et avec masque (bleu) en fonction de la défocalisation.

Objectif

L’objectif du stage est de réaliser une validation expérimentale des masques d’extension de profondeur de champ que nous avons optimisés et caractérisés de manière numérique. Ce projet fait appel à des compétences en optique, en modélisation électromagnétique et en traitement d’images. Il permettra d’acquérir des compétences expérimentales solides en microscopie optique et des compétences en traitement d’images en relation avec la physique des systèmes d’imagerie et de microscopie.

Au cours de ce projet, le ou la stagiaire interagira de manière étroite avec les chercheurs impliqués dans ce projet au LCF et au LP2N.

Sujet

Les principales étapes du travail seront les suivantes.

  1. Étude bibliographique sur la modélisation physique et la chaîne de traitement des images PALM.
  2. Réalisation d’un programme permettant de simuler de manière réaliste les images PALM classiques et leurs aberrations ainsi que de caractériser les performances de la chaîne de traitement. On se basera sur des données réelles acquises avec les microscopes PALM du LP2N.
  3. Adaptation de ce programme à l’imagerie à grande profondeur de champ utilisant nos masques de phase. Il sera nécessaire de prendre en compte les nouvelles formes d’images des particules obtenues avec nos masques, leur évolution avec la profondeur de champ, ainsi que les nouveaux algorithmes de localisation de particules adaptés à ces masques. Ce nouveau programme sera utilisé pour choisir les configurations expérimentales les plus favorables.
  4. Validation expérimentale des masques de phases binaires spécifiés dans [4]. Les mesures expérimentales seront réalisées à Bordeaux en collaboration avec le LP2N.
    Les étapes 3 et 4 seront réalisées en parallèle. Elles feront l’objet de nombreux allers retours sur la base d’une confrontation entre images simulées et images expérimentales.
  5. En fonction du temps disponible, le ou la stagiaire pourra aussi optimiser et caractériser d’autres structures de masques de phase pour l’augmentation de la profondeur de champ en microscopie PALM.

Dates du stage : mars-août 2021
Ce stage pourra se prolonger en thèse

Mots clés : traitement d’images, microscopie optique, imagerie pour la biologie, co-conception, modélisation, extension de la profondeur de champ

Références

[1] E. Betzig et al. “Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution” Science 313, 1642–1645 (2006).

[2] F. Diaz et al., “Real-time increase in depth of field of an uncooled thermal camera using several phase-mask technologies”, Opt. Lett. 36 (3), 418-420 (2011).

[3] R. Falcón, F. Goudail, C. Kulcsár, H. Sauer, “Performance limits of binary annular phase masks codesigned for depth-of-field extension,” Opt. Eng. 56(6), 065104 (2017).

[4] O. Lévêque, C. Kulcsár, A. Lee, H. Sauer, A. Aleksanyan, P. Bon, L. Cognet, and F. Goudail, “Co- designed annular binary phase masks for depth-of-field extension in single-molecule localization microscopy”, to appear in Optics Express.

[5] P. Bon, J. Linarès-Loyez, M. Feyeux, K. Alessandri, B. Lounis, P.Nassoy, L. Cognet, “Self-interference 3D super-resolution microscopy for deep tissue investigations”, Nature Methods 15, 449–454 (2018)

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