[STAGE] Co-conception du traitement d’images et de l’optique pour augmenter la profondeur de champ en microscopie super-résolue (PALM)

Aujourd'hui plus que jamais, le microscope optique est un outil incontournable du biologiste. Visualiser en direct des processus cellulaires aussi précis que le recrutement dynamique de calcium qui intervient dans la plasticité des neurones, ou le devenir de certaines protéines lors de la division cellulaire, sont des prouesses rendues possibles grâce au développement d'une nouvelle méthode d’imagerie appelée microscopie par localisation photo-activée (ou imagerie PALM).

Cette méthode permet, grâce à des techniques élaborées de traitement d’images, d’estimer la position d’une particule fluorescente avec une précision bien supérieure à la limite de diffraction et ainsi de reconstruire des images dites « super-résolues » ayant une résolution nanométrique [1]. Avec cette approche, les biologistes cherchent aujourd’hui à imager des milieux biologiques de plus en plus épais et de moins en moins transparents. Dans ce cas, l’image des particules n’est plus focalisée, ce qui entraîne une forte dégradation de la résolution. Il faut donc augmenter la « profondeur de champ » du microscope, c’est à dire améliorer la précision de localisation d’une particule fluorescente le long de l’axe optique.

Notre équipe développe depuis plusieurs années des masques de phase placés dans la pupille d'une optique afin d'étendre sa profondeur de champ en imagerie classique [2,3]. Nous avons récemment généralisé cette approche pour développer des masques de phase et des algorithmes de traitement adaptés à la microscopie PALM [4]. Nous mettons pour cela en œuvre une approche de « co-conception », c’est-à-dire que les profils des masques sont optimisés en prenant en compte le traitement numérique appliqué aux images. D’un point de vue applicatif, nous avons montré par de simulations numériques sur des modèles d’images simples que cette nouvelle approche augmente de manière significative la profondeur d'exploration des méthodes d'imagerie de localisation de la molécule unique (voir Figure 1), ce qui est un enjeu fondamental dans l'étude des milieux biologiques.

Ces travaux sont menés en étroite collaboration avec l’équipe du laboratoire LP2N en Optique et Biologie. Cette équipe met en œuvre des microscopes PALM et est reconnue mondialement pour son expertise dans le développement de la microscopie à très haute résolution pour l’étude de la matière biologique et nanométrique [5].

Figure 1 : (a) Masque optimal à deux anneaux. (b) Variation du profil transversal de la PSF en fonction de la défocalisation lorsque le microscope est équipé d’un masque optimal. (c) Précision de localisation sans masque (pointillés) et avec masque (bleu) en fonction de la défocalisation.

L’objectif du stage est de développer de nouvelles méthodes de traitement des images PALM à profondeur de champ étendue afin d’atteindre dans les images réelles les performances prédites par les modèles théoriques utilisés jusqu’à maintenant. Pour cela, il faudra développer de méthodes de traitement d’image plus élaborées et adaptées aux conditions d’imagerie réelles. Cela induira également une évolution des critères d’optimisation des masques et peut conduire à la découverte de nouveaux masques plus adaptés à ces conditions. Les résultats de ces études seront validés expérimentalement par des mesures réelles réalisées sur les microscopes du LP2N.

Ce projet fait appel à des compétences en théorie de la détection et de la localisation, en traitement des images et en modélisation optique. Il permettra d’acquérir des compétences de pointe en traitement d’images en relation avec la physique des systèmes d’imagerie et de microscopie. Au cours de ce projet, le ou la stagiaire interagira de manière étroite avec les chercheurs impliqués dans ce projet au LCF et au LP2N.

Ce stage est susceptible de se prolonger par une thèse.

Les principales étapes du travail seront les suivantes.

1. Étude bibliographique sur l’état de l’art en matière de chaîne de traitement des images PALM classiques (pré-détection des pics, localisation lorsque la PSF n’est que partiellement connue, prise en compte du fond non-uniforme des images, …).
2. Réalisation d’un programme intégrant une simulation réaliste des images PALM à profondeur de champ étendue et une chaîne de traitement complète de ces images. Pour cela, on se basera sur l’analyse des données réelles acquises avec les microscopes PALM du LP2N.
3. Conception de méthodes de traitement d’images PALM réelles dans un contexte de profondeur de champ étendue. En particulier :
   1. Développement de méthodes de pré-détection des pics en présence d’aberrations non contrôlées et de fond non-uniforme.
   2. Localisation précise des particules lorsque la PSF du microscope n’est que partiellement connue et varie avec la profondeur.
      Les résultats de ces études conduiront à revoir les critères optimisation des masques d’observation de la profondeur de champ, et donc à concevoir de nouvelles formes de masques plus adaptées aux conditions réelles d’imagerie.
4. Validation expérimentale des méthodes développées sur des images réalisées avec des masques de phase optimaux. Les images seront acquises à Bordeaux en collaboration avec le LP2N.

Les étapes 3 et 4 seront réalisées en parallèle. Elles feront l’objet de nombreux allers retours sur la base d’une confrontation entre les traitements sur les images simulées et sur les images expérimentales.

Dates du stage : mars-août 2021

Mots clés : traitement d’images, microscopie optique, imagerie pour la biologie, co-conception, modélisation, extension de la profondeur de champ

[1] E. Betzig et al. “Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution” Science 313, 1642–1645 (2006).

[2] F. Diaz et al., “Real-time increase in depth of field of an uncooled thermal camera using several phase-mask technologies”, Opt. Lett. 36 (3), 418-420 (2011).

[3] R. Falcón, F. Goudail, C. Kulcsár, H. Sauer, “Performance limits of binary annular phase masks codesigned for depth-of-field extension,” Opt. Eng. 56(6), 065104 (2017).

[4] O. Lévêque, C. Kulcsár, A. Lee, H. Sauer, A. Aleksanyan, P. Bon, L. Cognet, and F. Goudail, “Co- designed annular binary phase masks for depth-of-field extension in single-molecule localization microscopy”, to appear in Optics Express.

[5] P. Bon, J. Linarès-Loyez, M. Feyeux, K. Alessandri, B. Lounis, P.Nassoy, L. Cognet, “Self-interference 3D super-resolution microscopy for deep tissue investigations”, Nature Methods 15, 449–454 (2018)

• François GOUDAIL - francois.goudail@institutoptique.fr
• Caroline KULCSÁR - caroline.kulcsar@institutoptique.fr
• Olivier LÉVÊQUE - olivier.leveque@institutoptique.fr